Fuentes Giselle a b, Iglesias Azucena a b, Orallo Dalila c, Fangio Florencia c e, Ramos Facundo a b d, Mitton Giulia a b, Fuselli Sandra a b, Matias Maggi a b, Cristina L. Ramirez c

Abstrakt

Paenibacillus larvae je grampozitivní bakterie a etiologický původce americké hniloby včelího plodu (AFB), onemocnění, které postihuje larvy včel. Při hledání přírodních produktů, které by byly schopny tuto chorobu potlačit, jsme testovali antibakteriální aktivitu extraktů z květenství a kořenů konopí setého (Cannabis sativa l) proti P. larvae, Escherichia coli a Staphylococcus aureus pomocí mikrodiluční bujónové metody. Extrakty jsme chemicky charakterizovali podle obsahu polyfenolů, flavonoidů, saponinů a těkavých látek a analyzovali jsme antioxidační kapacitu. Nakonec byl hodnocen jejich možný toxický účinek na včelí larvy. Náš výzkum ukázal rozdíly v chemickém složení extraktů z květů a kořenů i v jejich antioxidačním potenciálu; vysokou účinnost a působení proti (AFB) in vitro, ale nízkou toxicitu pro larvy včely medonosné.

Úvod

Paenibacillus larvae je etiologickým původcem americké hniloby včelího plodu (AFB), bakteriálního onemocnění, které postihuje chov včely medonosné (Apis mellifera) během larválního nebo kukelního stadia (De Graaf et al., 2013; Genersch et al., 2006). Jedná se o grampozitivní bakterii, jejíž hlavní charakteristikou je tvorba vysoce infekčních endospor a dlouhodobá odolnost vůči nepříznivým podmínkám prostředí (Morse a Nowogrodzki, 1990). Pro potlačení této choroby používají včelaři antibiotika jako alternativu ke spálení infikovaných včelstev (Alippi a Reynaldi, 2006), přičemž nejčastěji používaným prostředkem je oxytetracyklin. V mnoha zemích včetně Argentiny však toto antibiotikum potlačuje klinické příznaky tím, že potlačuje pouze vegetativní buňky, ale spory bakterií se hromadí v úlu a medu a zůstávají infekční po mnoho let (Alippi et al., 2004). Rozsáhlé a nesprávné používání těchto látek vyvolalo silný selekční tlak na různé bakteriální populace, které se staly rezistentními v několika zemích světa, včetně Argentiny (Alippi a Reynaldi, 2006; Gende a kol., 2010). V současné době se přírodní pesticidy staly preferovanou variantou syntetických léčiv (Bilikova et al., 2013; Eguaras et al., 2005), protože mají nižší toxicitu pro savce, málo znečišťují životní prostředí a jsou široce přijímány veřejností (Isman, 2000). V posledních letech bylo provedeno několik studií zaměřených na identifikaci přírodních sloučenin s antibakteriální aktivitou proti P. larvae. Tyto studie zahrnovaly esenciální oleje (Alippi et al., 1996; Ansari et al., 2016; Gende et al. 2014; Tutun et al., 2018); čisté sloučeniny extrahované z rostlin, bakterií nebo hub (Flesar et al., 2010; Fuselli et al., 2006; Lokvam et al., 2000;

Sabate et al., 2012); vedlejší produkty včel, jako je mateří kašička (Bilikova et al., 2013) a propolis (Antúnez et al., 2008; Isidorov et al., 2018; Fangio et al., 2019); a rostlinné extrakty (Boligon et al., 2013; Chaimanee et al., 2017; Damiani et al., 2014; Fernández et al., 2019; Kang et al., 2018). 

Cannabis sativa L. je jednoletá bylina z čeledi Cannabaceae, která pochází ze střední Asie, kde hrála historicky významnou roli v léčbě (Frassinetti et al. 2020). Konopí seté obsahuje mezi svými sloučeninami klasické kanabinoidy, jedinečnou skupinu sekundárních metabolitů, které jsou zodpovědné za zvláštní farmakologické účinky rostliny (Fischer et al. 2015). Hlavní psychoaktivní sloučenina delta-9-tetrahydrokanabinol (Δ9-THC) a nepsychoaktivní složka kanabidiol (CBD) byly předmětem studií pro farmaceutický průmysl, nicméně nárůst objevů nových kanabinoidů se v současnosti pohybuje kolem 115 sloučenin (Martinenghi et al., 2020). Objev těchto metabolitů přítomných v rostlině konopí se v posledních letech zaměřil na výzkum kanabinoidů a jejich vlastností jako baktericidních látek (Karas et al., 2020; Martinenghi et al., 2020; Wassmann et al., 2020). Rostlina C. sativa má sekreční struktury, konkrétně žláznaté trichomy, které kromě kanabinoidů produkují esenciální olej složený z monoterpenů a seskviterpenů s hořkou chutí (Happyana a Kayser, 2016). Obecně monoterpeny poskytují různé léčivé vlastnosti, jako jsou mimo jiné antimikrobiální, antioxidační, protirakovinné a antiarytmické (Koziol et al., 2014); tyto vlastnosti lze přisoudit také seskviterpenům, které se nacházejí jak ve chmelu, tak v konopí (Booth a Bohlmann, 2019). Zatímco antibakteriální vlastnosti monoterpenů, jako je linalool (Koziol et al., 2014; Nuutinen, 2018), a seskviterpenů, jako je alfa-kariofilen, jsou známé (Booth a Bohlmann, 2019; Nuutinen, 2018), existují i další přírodní metabolity konopí s touto vlastností, jako jsou fenolové sloučeniny, např. karvakrol, eugenol, thymol atd. (Dorman a Deans, 2000; Knobloch et al.), 1986; Lambert a fowler. 2005), polyfenoly (Frassinetti et al., 2020; Mkpenie et al., 2012) y saponiny (Sparg et al., 2004). V rostlině plní mimo jiné úlohu poskytovat odolnost a ochranu proti patogenům a predátorům (Bravo, 1998; Osbourn, 2003; Treutter, 2005).

Kombinace kanabinoidů dohromady a nekanabinoidních složek by mohla synergicky posílit příznivé účinky přípravků z konopí (Pollastro et al., 2018). Antibakteriální aktivita zjištěná u Cannabis sativa může pravděpodobně vyplývat z tohoto synergismu (Dhifi et al., 2016; Iseppi et al., 2019). Vztahy mezi chemickým složením a bioaktivitou nevykazují vždy jasnou korelaci mezi relativním množstvím nejreprezentativnějších sloučenin v extraktech a jejich bioaktivitou (Iseppi et al., 2019), a i když ano, mnoho výzkumníků tvrdí, že na antimikrobiální aktivitě se může podílet více složek (Frassinetti et al., 2020; Nissen et al., 2010; Pellegrini et al., 2020; Zengin et al., 2018), i když jsou přítomny v menším množství (Dhifi et al., 2016).

Další důležitou vlastností metabolitů konopí je jejich antioxidační potenciál; volné radikály a zejména reaktivní formy kyslíku (ROS) jsou hlavní příčinou stárnutí a poškození tkání. Nadprodukce ROS, nejčastěji způsobená nadměrnou stimulací NAD(P)H cytokiny nebo mitochondriálním elektronovým transportním řetězcem a xantinoxidázou, vede k oxidačnímu stresu (Maietti et al., 2017). Antioxidanty rostlinného původu jsou schopny eliminovat z organismu reaktivní kyslíkové a dusíkové radikály, které nevratně poškozují živé tkáně a vyvolávají závažná onemocnění. Klíčovou roli v antioxidační aktivitě hrají polyfenoly, flavonoidy, například kanflaviny A a B, a terpeny, například alfa-pinen (Frassinetti et al., 2020; Hasemkamp, et al. 2010; Krofta et al., 2008; Nuutinen, 2018).

Včela medonosná je jedním z dominantních druhů navštěvujících rostliny konopí za účelem sběru pylu během kvetení (Dalio, 2012; O Brien et al., 2019). Kromě těchto předchozích studií, které ukazují význam C. sativa jako zdroje potravy pro včely, dosud neexistují studie, jejichž cílem by bylo posoudit využití konopí proti patologickým stavům včel. S ohledem na to, že výtažky z rostlin konopí byly studovány jako insekticidy v rámci jiných programů ochrany proti škůdcům a produkce potravin (McPartland a Sheikh, 2018; Tabari et al., 2020) a že výzkum potenciálních antimikrobiálních vlastností sloučenin odvozených od konopí je ve fázi exponenciálního růstu. Cílem této práce je ověřit, zda mohou mít extrakty z konopí také antibakteriální účinky proti larvám Paenibacillus. Pro pochopení potenciálních antimikrobiálních vlastností extraktů z konopí je analyzováno jejich chemické složení a testovány možné letální účinky na larvy včely medonosné in vitro. Navrhuje se vyhodnotit potenciální využití konopí jako přírodní alternativy pro kontrolu AFB.

Úryvky z oddílů

Rostlinný materiál

Rostlinný materiál poskytla nevládní organizace CBG 2000 z města Mar del Plata a byl charakterizován v herbáři cévnatých rostlin MDQ Ústavu pro výzkum moří a pobřeží (IIMyC, UNMdP-CONICET/FCEyN). Laboratoř rostlinné rozmanitosti. Juan B. Justo 2550, Mar del Plata (7600), Buenos Aires, Argentina. Uděleno číslo voucheru, jak je zaznamenáno v herbářové databázi MDQ: IMyCHer:MDQ:00630. Květenství byla zpracována jemným mletím, rozložena jako tenké lůžko a vystavena teplotě…

Chemická charakterizace

Extrakty kořenů i květů vykazovaly podobné hodnoty flavonoidů, což však neplatilo pro celkové polyfenoly, jejichž obsah byl vyšší v extraktu květenství. Kromě toho byla zjištěna vysoká antioxidační kapacita v extraktu z květů. Na druhou stranu byl vyšší obsah saponinů v extraktu z kořene. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr čtyřnásobně provedených analýz ± směrodatná odchylka (tabulka 1).

Těkavé organické sloučeniny (VOC)

Hlavní těkavé sloučeniny kořene

Diskuse

Antioxidační kapacita zjištěná v rostlinných extraktech byla v několika studiích přisuzována polyfenolům, flavonoidům a obecně fenolickým sloučeninám, mimo jiné sekundárním metabolitům (Karabin et al., 2015; Mašek et al., 2014; Mongelli et al., 2016; Schroeter et al., 2002). Naše extrakty se neliší v celkovém obsahu flavonoidů, ale v množství celkových polyfenolů, což by mohlo naznačovat, že antioxidační aktivita pozorovaná v extraktu z květů je způsobena přítomností neflavonoidních polyfenolů.

Závěr

Od objevu metabolitů přítomných v rostlině Cannabis se výzkum zaměřil na kanabinoidy a zjistil několik vlastností souvisejících s lidským zdravím a pohodou. Tato práce se snaží rozšířit rozsah vlastností rostlin, jako jsou antibakteriální vlastnosti konopí, s cílem prospět zdraví jiných druhů a napravit škody způsobené nevybíravým používáním antibiotik. Ukazujeme tedy, jak lze pomocí jednoduchých extrakčních metod získat extrakty, které 

Příspěvky autora

MM a RC koncipovali tento výzkum a navrhli experimenty; FG, IA, OD, FF, RF, MG a FS se podíleli na interpretaci dat; FG, OD, FF a RC provedli experimenty a analýzu; FG, OD, MM a RC napsali článek. Všichni autoři přečetli a schválili konečnou verzi rukopisu.

Prohlášení o konkurenčním zájmu

Autoři prohlašují, že jim nejsou známy žádné konkurenční finanční zájmy ani osobní vztahy, které by mohly ovlivnit práci uvedenou v tomto článku.

Poděkování

Děkujeme Dr. Moliné María de la Paz a Dr. Fernandez Natalia za jejich doporučení, velkorysost a kamarádství; Juanu Franciscu Cordobovi za spolupráci při terénních úkolech. Děkujeme také UNMDP, CONICET a ANPCyT za finanční podporu.

Tato práce byla podpořena grantem Pict 2823-2017. MINCYT.

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1878818122003024

Foto: Adobe Stock